El metotrexato (MTX) se usa comúnmente como agente de quimioterapia y supresor del sistema inmunitario, pero su efecto adverso en el sistema reproductor masculino sigue siendo limitado. Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto del MTX sobre la estructura y las proteínas funcionales del testículo y la vesícula seminal. Ratas macho adultas se dividieron en grupos control y grupo con MTX (n = 12). En 30 días experimentales, a los animales tratados se les inyectó MTX (cola i.v., 75 mg / KgBW) los días 8 y 15. Luego, se examinaron los parámetros reproductivos y la histología de ambos grupos. Se analizó el espesor del epitelio de la vesícula seminal. Además, se investigaron las expresiones de la proteína tirosina testicular fosforilada y de la proteína reguladora aguda esteroidogénica (StAR). Los resultados mostraron que el MTX podría disminuir significativamente la concentración de espermatozoides epididimarios. Además, se observó la degeneración de las células germinales, el aumento de los espacios de los tejidos intersticiales y la baja densidad de masa del espermatozoide epididimal en el grupo de MTX. El grosor del epitelio de la vesícula seminal en el grupo MTX fue significativamente menor que el del grupo control. Además, la intensidad de las proteínas testiculares fosforiladas de 31, 32, 72 y 85 kDas aumentó significativamente, mientras que la de 42 y 47 kDas en el grupo MTX disminuyó en comparación con el control. La expresión de la proteína StAR testicular en el grupo MTX también se redujo significativamente en comparación con el control. En conclusión, el MTX afecta los tejidos testiculares y seminales y cambia las proteínas funcionales testiculares en ratas adultas.